蛋白质印迹的一抗选择指南

多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体对比情况

多克隆 单克隆 重组 定义 收集来自不同B细胞的抗体，这些抗体可识别同一抗原上的多个表位。 由相同的B细胞克隆产生的单一抗体，可识别同一抗原上的一个表位。 源自重组DNA的单一抗体。可在DNA水平上进行修饰或用于生成 特定的抗体池。 优点 灵敏度高。多克隆抗体库中的许多抗体可以结合抗体靶标上的表位。 批次间一致性。通常具有良好的特性、特定克隆的来源背景、以及记载了在蛋白质印迹法中使用情况的出版文献。 长期稳定供应批次间一致性。不易受到细胞系漂移的影响。 缺点 抗体池批次间差异可能导致检测不一致。与目标相似的表位可能导致非特异性条带的检测。 检测灵敏度取决于单个表位的丰度和暴露程度。细胞系漂移可能导致抗体发生细微的长期变化。 非常专业且依赖表位。开发时间较长。可能需要更多前期优化。通常价格较高。

       多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体都适用于蛋白质印迹法。多克隆抗体是许多单克隆抗体的集合，这些抗体可能因免疫接种和批次而异。多克隆抗体可识别抗原的多个表位，因此通常比仅识别一个表位的单克隆抗体更敏感。当表位丰度、表位掩蔽或表位暴露成为问题时，这可能是一个优势。多克隆抗体的成本较低，生产时间也较短。

 

       单克隆抗体的价值在于其批次间一致性，以及在许多情况下大量的表征实验和出版文献。单克隆抗体通常由产生一个单独抗体克隆的细胞系产生。当需要生产抗体时，这些细胞系（或杂交瘤）在细胞培养中生长。就像任何经常繁殖的细胞系一样，这些细胞系可能会逐渐发生变化，影响抗体生产产量甚至抗体特性。

 

       重组抗体是实现一致的体外抗体生产和批次间一致性的最佳选择。重组抗体是通过将编码所需免疫球蛋白的重组DNA转染生产细胞系而产生的。重组抗体有几个优点：它们可以在特定位点进行修改，以向IgG添加所需的特性，并且它们不会像杂交瘤衍生的单克隆抗体那样受到细胞系漂移的影响。重组抗体可以汇集起来生成重组抗体池，例如重组多克隆一抗或超克隆重组二抗。

 

       抗体通常以PBS或类似缓冲液纯化提供；但在某些情况下，为了保持某些抗体特性或抗体产量，需要使用血清或腹水等粗抗体制剂。优化蛋白质印迹实验方案以尽量减少粗抗体制剂中存在的杂质对背景的影响非常重要。

 

直接检测与间接检测

 

       直接和间接检测方法都可用于蛋白质印迹法。每种方法都有各自的优点和缺点。使用直接检测法，使用酶或荧光团偶联的一抗来检测印迹上的目标抗原。在间接检测法中，首先使用未标记的一抗与抗原结合。随后，使用酶或荧光团偶联的二抗检测一抗。间接方法比直接方法具有许多优势，如下所述。

成分 直接法 间接法 描述 一抗与酶或荧光染料偶联以便直接检测。 使用酶或荧光团偶联的二抗检测未标记的一抗。 优点 -仅需要一种抗体。 -通过消除二抗孵育步骤节省时间。 -消除某些样品中二抗交叉反应可能产生的背景。 -信号放大，因为多个标记的次级分子与每个初级分子结合。 -使用HRP、Alexa Fluor或Alexa Fluor Plus标记的二抗的多种选择。 -使用荧光二抗进行多重检测，节省时间。 -利用生物素化的二抗和荧光或酶标记的链霉亲和素可以进一步放大信号。 缺点 -标签可能会干扰目标结合，导致灵敏度降低和背景升高。 -直接结合的一抗的选择有限。 -需要采取额外步骤。 -非特异性结合的可能性可能会增加某些样品的背景。

宿主物种考虑

 

       多种物种都可生成用于蛋白质印迹实验的抗体。最常见的是：小鼠、兔、大鼠、山羊、驴和鸡。选择哪种宿主物种一抗取决于在多重蛋白质印迹实验中是探测单个靶标还是探测多个靶标。

 

       当一次只研究一种抗原时，理论上可以使用任何宿主物种，但大多数用于蛋白质印迹的初级研究抗体都是由免疫兔（多克隆、单克隆、重组）或小鼠（杂交瘤衍生的单克隆）产生的。一些宿主物种由于它们的体型大小或免疫生物学因素，比其他物种具有额外的优势。例如，当比较小鼠或兔子时，兔子通常更能耐受免疫，并且寿命比小鼠长得多。此外，兔子比小鼠表现出更多样化的天然抗体库，这使得兔子成为产生多克隆、单克隆和兔重组抗体的常用宿主。当旨在产生最适合蛋白质印迹的单克隆或重组抗体时，兔子产生的抗体库越多，就越能成功地筛选、分离和克隆高亲和力重组抗体。在制造针对更具挑战性的表位的蛋白质印迹抗体时，这一点尤其重要，因为其他系统可能无法生产这些表位。

 

       进行多重蛋白质印迹实验时，针对每个目标使用来自不同宿主物种的一抗。理想情况下，使用来自两种远亲物种（如大鼠和兔）的抗体组合，避免使用小鼠和大鼠或山羊和绵羊的组合。这将有助于选择合适的二抗，以最大限度地减少潜在的抗体交叉反应，因为交叉反应可能会导致令人困惑的结果。

多重宿主考量的注意事项

一抗体宿主物种 二抗宿主物种   小鼠 兔子 ? 小鼠 兔子 ? 山羊 兔子或小鼠 ? 小鼠 小鼠 ? 山羊 棉羊 ?

经蛋白质印迹验证的抗体

 

       尽管抗体旨在识别特定靶抗原，但它们在所有应用中的效果可能并不相同。选择专门用于蛋白质印迹或将蛋白质印迹列为应用的抗体。此外，确认抗体对天然或变性蛋白质具有特异性也很重要，以确定是否应进行SDS-PAGE或天然PAGE。

 

选择一抗时，请确认：

1.抗体经过蛋白质印迹验证

2.抗体对天然或变性蛋白质的特异性

 

       阿拉丁抗体经过严格的两部分测试方法。第 1 部分：靶标特异性验证，第 2 部分：功能应用验证。靶标特异性验证有助于确保抗体与正确的靶标结合，而功能应用验证是测试抗体在特定应用中是否产生可接受的结果。两部分结果都可以直接在阿拉丁官网进行查看。

 

●  内参对照

 

找到正确的上样对照

 

       选择上样对照或管家基因编码蛋白是蛋白质印迹标准化的一个重要方面。由于各种原因，并非所有上样对照都可以平等地用于所有生物测试系统中的标准化研究。例如，如果使用化学发光或单色荧光系统进行靶标检测，管家基因编码蛋白不应干扰靶标的检测（例如，不应具有相似的分子量）。此外，在用于蛋白质印迹标准化之前，应评估生物测试系统中上样对照的定量准确性和线性范围。上样对照获得的信号应在很宽的浓度范围内呈线性，以便可以将其用作标准化的可靠参考。

 

       如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

      https://www.aladdin-e.com