细胞表面蛋白的检测主要针对细胞膜上的抗原，抗体能够直接与细胞表面的抗原结合，因此通常无需进行固定和通透处理，实验操作相对较为简便，主要关注点在于抗体的特异性和浓度的优化。

         然而，FoxP3和转录因子等核内蛋白的检测则需要特殊的固定和通透步骤。这些蛋白位于细胞核内，抗体无法直接穿透细胞膜和核膜与之结合，因此必须通过固定处理来固定细胞结构，并使用通透缓冲液使细胞膜和核膜变得通透，从而允许抗体进入细胞核与目标蛋白结合。此外，转录因子检测还需要优化固定和通透条件，以减少非特异性背景染色，确保实验结果的准确性和可靠性。

         本文主要介绍转录因子在进行流式细胞染色时，常用的细胞固定和通透的实验操作。

一、实验前准备

         对于贴壁细胞或组织样本，需先将其分离为单细胞悬浮液。

         如果处理全血样本，请在固定前使用红细胞裂解缓冲液（R478427）裂解红细胞，并通过离心分离细胞后进行洗涤。

         如果使用可固定的死活细胞鉴定染料，应在固定前添加，并在去除多余染料后继续进行固定步骤。

         靶向细胞表面标记物（如CD标记物）的抗体可以在固定前添加，并在固定过程中保持与目标抗原的结合。有需要的话，固定前的可以先进行一次洗涤。

         离心条件需根据细胞类型和样本量调整，一般建议150-300 g离心1-5分钟。

二、固定与通透

1.离心获得细胞沉淀，移除上清液。

2.用1 mL 4%多聚甲醛重悬细胞，轻轻混匀以分散细胞团块，避免细胞交联。

3.室温（20-25℃）下避光孵育10-15分钟。

4.用1×PBS清洗细胞两次。

5.每10?个细胞加入100 μL含有0.1% Triton X-100的1× PBS，室温孵育10-15分钟。离心，弃去上清液。

6.用含0.05%-0.1% Tween-20的1×PBST清洗细胞两次。

7.用封闭液（如正常山羊血清或BSA）封闭细胞，室温孵育30-60分钟。

三、免疫荧光染色

1.细胞计数：使用血细胞计数器或其他方法对细胞进行计数。

2.将细胞按实验需求分装到试管或小孔中，每次检测建议使用5×10?至1×10?个细胞。

3.按照抗体产品建议稀释浓度，用100 μL 1×PBST稀释抗体，然后吸取抗体稀释液重悬细胞。

4.室温（20-25℃）下避光孵育1小时。

5.用足量1×PBST离心洗涤细胞，弃去上清液，重复洗涤步骤两次。

6.如果使用荧光素偶联的一抗，洗涤后可直接用200-500 μL 1×PBST中重悬细胞，并进行流式细胞术分析。如果使用非偶联一抗，则需继续下一步。

7.按照荧光素偶联的二抗推荐稀释浓度，用1×PBST稀释二抗，然后重悬细胞。

8.室温（20-25℃）下避光孵育30分钟。

9.使用1×PBST离心洗涤细胞，弃去上清液，重复洗涤步骤两次。

10.取200-500 μL 1×PBST中重悬细胞，进行流式细胞术分析。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com