重要事项：请参阅产品网页上的产品专用流式细胞术实验步骤，以了解相应的固定和通透条件以及建议的抗体稀释比例。
一、甲醇通透实验步骤
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液。
1. 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1× PBS：添加 100 mL 10× PBS（P492453）至 900 mL 水，然后将其混合。
2. 4% 多聚甲醛，无甲醇（P395744）
3. 100% 甲醇（M116128）：使用前先冷却
4. 抗体稀释缓冲液：100 mL 1× PBS中溶解 2 mL的胎牛血清（FBS）来制备 含2% FBS的PBS缓冲液，4°C 保存。
5. 推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与您的一抗（例如鼠）的宿主物种匹配的二抗。点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。
6. 红细胞裂解液（R767015）
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。
B. 固定
1. 固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。
2. 理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，5分钟400-500g将足以使细胞沉淀下来。
3. 如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
4. 如果表位被多聚甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向CD标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。
固定操作步骤：
细胞离心后，按每100万个细胞大约100 μL 4%多聚甲醛重悬细胞，室温固定10~15分钟。或者用预冷的冰甲醇（100%）于-20℃冰箱中固定5分钟，甲醇同时具有固定和透化作用，若使用甲醇固定则无需后续的透化步骤。固定结束后加入适量体积的流式缓冲液，1200 rpm离心5分钟后弃上清；再加入适量体积的流式缓冲液重悬，1200 rpm离心5分钟后弃上清。
1. 继续进行细胞免疫染色（C部分）或将细胞在洗掉甲醇后重悬于PBS中在4℃冰箱保存。
2. 加入封闭剂：如果样品来源于人类，则可以使用人血清作为Fc封闭剂，如果样品来源于小鼠，则可以使用1ug/ml anti mouse CD16/CD32 （Ab093991）作为Fc封闭剂。
C. 免疫染色
注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用2×105 至1×106 个细胞）。
2. 通过离心以过量 1× PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
3. 在 100 μL 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 4℃孵育1小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1× PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液，重复洗涤细胞2次。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
6. 在 100 μL 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 4℃孵育 30 分钟。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1× PBS 中通过离心洗涤，弃去上清液，重复洗涤细胞2次。
9. 在 200-500 μL 1× PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。
不同样本的制备说明：
血样:
1）将4 mL血样置于50mL离心管中；
2）取用适量的新鲜血样，加入相应体积的裂红液；
3）放置旋转仪上反应至血液呈半透明状，裂解过程最好不要超过10分钟，裂解过程中需要定期检查；
4）重复步骤3）一遍；
5）按照所需的体积用2% FBS/DPBS重悬细胞。
血小板：
方法一：
1）在采血10分钟内，将100 μL未刺激或激活的全血移液管放入12 × 75毫米的试管中，试管中含有1 mL的冷（2℃至8℃） 4%多聚甲醛溶液。
注:100 μL全血可产生足够20次试验的固定血。
2）将血小板固定在2°C至8°C至少2小时。固定血小板可以稳定5天。储存在2°C至8°C。
3）染色前，固定血在室温（20°C ~ 25°C）下600 × g离心5分钟。
4）去除上清液，加入1ml室温洗涤缓冲液（1×PBS）。
5）通过涡旋重悬沉淀。在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。
6）取出上清液并将沉淀重悬在 1 mL 的室温染色缓冲液中。
7） 向 1 mL 全血中加入 约10 mL 室温 1× 红细胞裂解液，然后轻轻上下颠倒。
8）在室温下孵育约10分钟，不时观察红细胞裂解状态。
9）裂解结束后，在室温（20°C ~ 25°C）下600 × g离心5分钟。
10）用1 mL的FACS buffer重悬细胞，每孔加入20 μL的细胞悬液；
11）每孔加入100 μL稀释后的抗体，室温避光孵育30分钟；
12）孵育结束后，加入100 μL 的FACS buffer洗涤两次，每次室温下600 × g离心5分钟；
13）加入稀释后的二抗；
14）孵育结束后，加入100 μL 的FACS buffer洗涤两次，每次室温下600 × g离心5分钟；
15）重悬上机检测。
方法二：
1） 取全血6 μL/test加入到稀释好的抗体中，混匀，室温避光孵育40分钟.
2） 1200g离心5分钟,弃掉上清；200 μL FASC buffer重悬洗涤，洗一遍。
3） 200 μL FACS Buffer重悬上机。
二、Triton X-100 通透实验步骤
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液。
1. 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1× PBS：添加 100 mL 10× PBS（P492453）至 900 mL 水，然后将其混合。
2. 4% 多聚甲醛，无甲醇
3. 细胞通透缓冲液：30μL Triton X-100（T109027）至 10 mL 抗体稀释缓冲液来制备 10 mL。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：100 mL 1× PBS 中溶解 2 mL的胎牛血清（FBS）来制备含2% FBS的 PBS 缓冲液，4°C 保存。
5. 推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与您的一抗（例如兔）的宿主物种匹配的二抗。点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。
B. 固定与透化
1. 固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。
2. 理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，5 分钟 400-500g 将足以使细胞沉淀下来。
3. 如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
4. 如果表位被多聚甲醛和/或 Triton X-100 破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定，请进行小规模实验。
操作步骤：
1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每100万个细胞大约 100 μL 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温（20°~ 25°C）固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量1× PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
5. 在每一百万个细胞约100 μL 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
6. 在室温孵育10 分钟。
7. 继续进行染色或将细胞在PBS中 -4°C 保存过夜。
8. 加入封闭剂：如果样品来源于人类，则可以使用人血清作为Fc封闭剂，如果样品来源于鼠类，则可以使用小鼠血清作为Fc封闭剂。加入Fc封闭剂使其终浓度为5%，室温孵育15分钟。特别的，当使用鼠源样本时，如果验证抗体为PE标记的一抗，则需要用0.2 μg/mL CD16/CD32抗小鼠的抗体（Ab093991）作为封闭剂。
C. 免疫染色
注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
1. 将所需数目的细胞分装入试管或孔板中。（通常，每次检测用 2×105至 1×106 个细胞）。
2. 将细胞离心，弃去清液。
3. 在100 μL 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 4℃ 孵育1小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1× PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
6. 在 100 μL 稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在4℃下孵育30分钟。避光。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1× PBS中通过离心洗涤。弃去上清液，重复。
9. 在 1× PBS中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。
不同样本的制备说明：
血样:
1）将4 mL血样置于50 mL离心管中；
2）取用适量的新鲜血样，加入相应体积的裂红液；
3）放置旋转仪上反应至血液呈半透明状，裂解过程最好不要超过10分钟，裂解过程中需要定期检查；
4）重复步骤3）一遍；
5）按照所需的体积用2% FBS/DPBS重悬细胞。
T细胞系激活实验：选取生长状态良好的Jurkat、MOLT-4细胞，根据实验需要收集适量的细胞，离心去掉培养基后用新鲜培养基重悬，加入500 ng/mL Ionomycin（I139530）和10 ng/mL PMA（P408905），共培养24h。
血小板：
方法一：
1）在采血10分钟内，将100 μL未刺激或激活的全血移液管放入12 × 75毫米的试管中，试管中含有1 mL的冷（2℃至8℃）4%多聚甲醛溶液。
注：100 μL全血可产生足够20次试验的固定血。
2）将血小板固定在2°C至8°C至少2小时。固定血小板可以稳定5天。储存在2°至8°C。
3）染色前，固定血在室温（20°~ 25°C）下600 × g离心5分钟。
4）去除上清液，加入1 mL室温洗涤缓冲液（1×PBS）。
5）通过涡旋重悬沉淀。在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。
6）取出上清液并将沉淀重悬在 1 mL 的室温染色缓冲液中。
7）向 1 mL 全血中加入 约10 mL 室温 1× 红细胞裂解液，然后轻轻上下颠倒。
8）在室温下孵育约10 分钟，不时观察红细胞裂解状态。
9）裂解结束后，在室温（20°~ 25°C）下600 × g离心5分钟。
10）用1 mL的FACS buffer重悬细胞，每孔加入20 μL的细胞悬液；
11）每孔加入100 μL稀释后的抗体，室温避光孵育30分钟；
12）孵育结束后，加入100 μL 的FACS buffer洗涤两次，每次室温下600 × g离心5分钟；
13）加入稀释后的二抗；
14）孵育结束后，加入100 μL 的FACS buffer洗涤两次，每次室温下600 × g离心5分钟；
15）重悬上机检测。
方法二：
1）取全血6 μL/test加入到稀释好的抗体中，混匀，室温避光孵育40分钟.
2）1200g离心5分钟,弃掉上清；200 μL FASC buffer重悬洗涤，洗一遍。
3）200 μL FACS Buffer重悬上机。
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